文献标题：Evaluations of Clinical Utilization of Metagenomic Next-Generation Sequencing in Adults With Fever of Unknown Origin（宏基因组在发热待查患者中的应用评估研究）
发表期刊：Frontiers in Cellular and Infection Microbiology
影响因子：6.073
doi:10.3389/fcimb.2021.745156021.745156
研究背景
不明原因发热（或发热待查，FUO）被定义为发热持续3周以上，口腔体温至少3次>38.3℃（或至少3次体温在1天内波动>1.2℃），经过至少1周在门诊或住院的系统全面的检查仍不能确诊的一组疾病。在FUO的鉴别诊断中发现了200多种疾病，分为感染、非感染性炎症性疾病（NIID）、癌症、其他疾病和未解决的诊断。由于临床特征复杂且缺乏实验室分析指标，该病难以诊断，住院花费高。
mNGS技术由于无偏倚和高通量，能够检测样本所有基因组的特异性，使其在检测中枢神经、呼吸道感染、血流感染等传染病有着一定应用。但在不明原因发热中的性能研究仍有限。因此，在本研究中，研究人员对mNGS在华东FUO患者应用中的整体临床价值进行了回顾性队列分析，以评估mNGS的相关性能。
方法
█ 研究设计和参与者
研究纳入了2017年3月7日至2018年8月1日在华山医院诊断为不明原因发热的所有患者。
采集所有患者的血样同步进行培养和mNGS。其他检查如血常规、血液生化检查、自身免疫抗体等根据临床需要进行。如果怀疑患者有除血流感染以外的感染，也会将疑似感染部位的标本送去进行mNGS和上述检查。
（注：患者登记工作流程图）
下表为175例疾病情况，其中部分传染病患者感染两次以上，因此所有感染性疾病病例总数超过96例。
（表1）
█ mNGS检测阳性检测标准
☞满足以下4个条件的细菌真菌判定为阳性：
1、SDSMRN（标准化的特定reads：一种病原体每2000万测序量的reads）位于最高的前10个属中；
2、该菌种在属中排第一；
3、SDSMRN>1；
4、是常见的血液感染病原体。
☞病毒判定为阳性的标准：
1、SDSMRN最高的前三个病毒；
2、SDSMRN>5。
☞分枝杆菌属、诺卡菌属、布鲁氏菌属等DNA提取含量低的病原体判定为阳性的标准：
1、在前20的SDSMRN的属中；
2、SDSMRN>1；
3、属内第一。
☞对于肠杆菌科的病原体，只有最高SDSMRN的物种判定为阳性。
最终专家组基于症状、体征和药物使用情况临床解释测序的结果。
█ 宏基因组二代测序和数据分析
样品处理和核酸提取血样无需破壁操作，疑似病毒感染患者的样本提取RNA再逆转录。
DNA文库通过DNA片段化、末端修复、A加尾、接头连接和PCR扩增构建，然后采取50bp单端测序策略测序。
█ 生物信息分析
首先，去除低于35bp序列。然后，将质量过滤后的干净读数映射到包括hg19和炎黄基因组序列的人类参考数据库，剩余序列与细菌真菌寄生虫数据库对比。
█ 统计分析
用以下方式计算mNGS的病原体额外检出率（PEDR）和mNGS的改进诊断率（IDR）：
1、PEDRmNGS/培养=（mNGS真阳-培养阳性）/临床确诊感染
2、PEDRmNGS/常规检验=（mNGS真阳-常规检验阳性）/临床确诊感染
3、IDRBSI=（mNGS真阳血流感染-培养阳性血流感染）/怀疑数BSI
4、IDR血流感染并发其他感染=（mNGS真阳血流感染并发其他感染-培养阳性血流感染并发其他感染）/怀疑数血流感染并发其他感染
5、IDR非血流感染=（mNGS真阳非血流感染-培养阳性非血流感染）/怀疑数非血流感染
使用学生t检验分析基线特征的连续变体的优势比(OR) 和 95% 置信区间(95% CI)。亚组之间的差异比较使用McNemar检验和kappa检验分析。
研究结果
█ 入组患者的一般特征
研究一共纳入176例诊断为FUO的患者，并进行了临床基线筛查。其中1例因核酸质量低被排除，最终为175名患者。根据175名患者的最终诊断，这175名患者中有96名被归类为感染性疾病（ID），73名患者被归类为非感染性疾病（NID），其他6名患者为特发性疾病组（或原因不明的疾病，IG）。
此外，NID组进一步分为非感染性炎症性疾病（NIID）（n=39）、肿瘤（n=16）和其他疾病（n=18）。ID组和NID组的性别、年龄、白细胞计数（WBC）、C反应蛋白（CRP）、红细胞沉降率（ESR）和降钙素原（PCT）等基线数据无显著差异。
（表2：患者基线特征，其余六位为特发性疾病）
█ mNGS识别病原体的分布
结果表明，病毒是检出最多的病原体，其中EB病毒最多，其次是人类巨细胞病毒。鉴定出最多的细菌是结核分枝杆菌复合体和大肠杆菌，同时还检测到了种类繁多的真菌，如马尔尼菲青霉菌、曲霉属等。
在鉴定无法培养或培养耗时长的病原体方面如EBV、曲霉属和结核分枝杆菌复合物，mNGS比培养具有优势。然而，在这项研究中，mNGS的假阳性病例比培养的假阳性病例多。
【注：宏基因组二代测序（mNGS）检测到的病原体分布，分为细菌、寄生虫、真菌和病毒四个部分，每个部分由共同检出（蓝色）、额外检出（绿色）和假阳性（灰色）。】
█ 与培养相比，在感染引起的FUO中使用血样时mNGS的病原体额外检测率的诊断性能
总体PEDRmNGS/培养为22.9%，血流感染的PEDRmNGS/培养仅为38%，但非血流感染的PEDRmNGS/培养仅为6.5%。由此可得出结论：与单独培养相比，FUO患者血液样本的mNGS可能会使感染性病的病原体额外检出率增加22.9%（22/96vs.0/96；OR，∞；p=0.000）（表3）。血流感染案例中，血液mNGS的病原体额外检出率比培养高38%（19/50vs.0/50；OR，∞；p=0.000）（表3），但在非血流感染中血液mNGS检测的病原体额外检出率较低（仅有6.5%）（表3）。
（表3：mNGS与FUO血样中培养相比的诊断价值。*表示这些标本检出病毒，如CMV、EBV和HBV，并考虑病毒慢性感染或潜伏感染。）
96例中有8例感染性疾病检测mNGS和培养一致阳性，有66例一致阴性。22例mNGS检测阳性，培养阴性。没有出现培养阳性且mNGS为阴性的情况（表3）。mNGS和培养的一致性不高（Kappa值=0.342，p=0.000；McNemar，p=0.000），可能的原因是mNGS的总检出率比培养高22.9%（表3）。
█ 与常规检测相比，在感染引起的FUO中使用血液样本对mNGS的病原体额外检测率的诊断性能
血样的总PEDRmNGS/常规检测为19.79%，血流感染PEDRmNGS/常规检测为32%，非血流感染PEDRmNGS/常规检测为6.52%。mNGS的病原额外检出率都比常规检测更高。根据mNGS和传统方法的阴性结果以及诊断结果，mNGS排除感染性疾病方面比传统方法效果更好。（表3，表4）
（表4：与常规检测相比，mNGS在FUO血液样本中的诊断价值。*表示这些标本还检测病毒，如CMV、EBV和HBV，并考虑病毒慢性感染或潜伏感染。）
█ 与常规检测相比，在感染引起的FUO中使用非血液样本对mNGS的病原体额外检测率的诊断性能
非血液样本的总PEDRmNGS/常规检测为20%，其中非血流感染的PEDRmNGS/常规检测为26.2%，而血流感染的PEDRmNGS/常规检测仅为7.7%。与常规检测相比，非血液样本中使用mNGS在感染性疾病方面表现出更好的性能（9/45vs.2/45；OR，4.5；p=0.065），并将病原体检出率提高了20%。特别是在非血流感染中，非血液样本mNGS较常规检测增加了26.2%的病原体额外检出率（8/32vs.0/32；OR，∞；p=0.008）（表5）。
（表5：非血液样本中mNGS与常规检测相比，对FUO的诊断价值。）
█ mNGS在辅助FUO临床决策和提高诊断率中的应用
应用血液mNGS作为一线检查是诊断感染性FUO的有效策略。与培养相比，血液mNGS检测可使血流感染的诊断率提高10.9%。应用mNGS作为疑似感染的二线检测手段，对FUO的合并血流感染患者中，诊断率提高了66.7%。此外，mNGS可以诊断出比培养多12.5%的非血流感染疾病。
另外，mNGS可以诊断潜伏或慢性病毒感染（HBV、CMV、EBV等）的病例，这些病原体可能不是FUO的主要原因，但有助于后期的临床决策。
研究的局限性
首先，这是一项回顾性研究，单一中心样本量小；其次，有6名患者最终未确诊病因，这意味着仅mNGS不能作为FUO疾病的最终诊断工具。
总结
使用mNGS检测FUO患者的病原体比培养或其他常规检测具有更高的诊断敏感性，血样和非血样mNGS的感染性疾病的病原额外检出率（PEDR）均高于常规检测和培养，血样mNGS血流感染的PEDR较非血流感染的更高。
对于FUO患者，尤其是疑似感染性疾病患者，利用血液mNGS作为一线检测手段可提高诊断率；使用来自其他疑似感染部位的样本作为二线检测检测手段可以进一步提高诊断能力。
